电子束辐照抑制几种常见食源性致病菌生长的研究（一）

食源性致病菌可导致食源性疾病和食物中毒，是影响食品安全的最主要原因。据世界卫生组织统计，全球腹泻病例每年高达1.5亿，其中70％与食品污染致病微生物有关，我国致病性微生物污染导致的疾病在食源性疾病中占比高达46.4％。食源性致病菌多达几十种，在我国食源性致病菌监测中常见的有蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、创伤弧菌、阪崎肠杆菌等，在熟肉制品、即食豆制品、焙烤食品、中式凉拌菜、牛乳、盒饭等方便即食类食品中多有检出。

为保障食品安全，必须对食源性致病菌进行控制。我国2013年发布的《食品安全国家标准食品中致病菌限量(GB29921-2013)》中规定了肉制品、水产制品、粮食制品、豆类制品、果蔬制品、饮料及冷冻饮品、即食调味品共8大类即食食品的致病菌的限量标准。除金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌按三级采样方案允许有一定检出外，沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌0157：H7均要求无检出。方便即食类食品的安全性是第一需求，杀菌除虫是食品安全的关键技术环节，是延长食品保质期、保证食品食用安全的必不可少的措施。传统热杀菌是保持食品安全和货架期的主要技术，但热加工易导致食品过度熟化和维生素等营养物质损失。非热加工技术是一种相对新兴的技术，在加工中产品温升很低，对食品的感官和营养品质影响小，可避免食品色、香、味、质构的改变及营养损失。电子束辐照作为一种安全卫生、低碳高效的非热杀菌除虫技术，在控制食源性疾病、杀灭有害昆虫方面具有独特优势，还可降低一些食品y-射线加工的不良反应，能最大限度保持其原有的色、香、味，是不适于高温灭菌的冷冻、冷藏类食品加工的理想灭菌除虫技术。

研究证明，电子束能杀灭0157：H7大肠埃希氏菌、沙门氏菌属、李斯特氏菌属等食源性致病菌以及食物致腐微生物，在食品安全领域有良好应用前景。1.5kGy电子束辐照可杀灭鲜切哈密瓜接种的沙门氏菌：2kGy电子束辐照可杀灭牛肉香肠中接种的沙门氏菌，产品感官特性未受到显著影响；3kGy电子束辐照后，方便曲奇面团中接种大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌均无检出，面团的色泽和质构较未辐照处理未出现显著差异：6kGy电子束辐照可有效杀灭散装即食酱卤牛肉的大肠菌群和金黄色葡萄球菌。辐照杀灭微生物的有效性受微生物辐射耐受性和微生物数量的影响，微生物的耐受性越强、数量越多，杀灭微生物需要的辐照剂量越高。鲜切果蔬等食品因品质保持需求，对辐照剂量有一定的限制要求，实际生产中辐照剂量较低。而亚致死的低剂量辐照作为一种外加的逆境刺激，可能引起微生物的应激反应，从而影响辐照效果。目前关于低剂量电子束处理对食源性致病菌生长影响还少见报道，作者以常见食源性致病菌大肠埃希氏菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌为对象，研究亚致死剂量电子束辐照对微生物生长的影响，以期为电子束辐照在食源性疾病控制中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、大肠埃希氏菌ATCC25922：购自广东环凯微生物科技有限公司；单核细胞增生李斯特氏菌BNCC336877：购自商城北纳创联生物科技有限公司；蜡样芽孢杆菌B10：购自上海市工业微生物研究所菌种保藏中心；培养基：购自北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 供试菌液制备

鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌、蜡样芽孢杆菌冷冻甘油保藏菌种复苏，TSB培养基35℃培养过夜，PCA培养基划线接种，35℃培养48h得到单菌落，挑取单菌落再次在TSB培养基于35℃培养过夜增菌，控制菌量在107水平，得到供试菌液。

1.3 辐照处理

1.3.1 致病菌辐照D₁₀值设定

剂量为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2kGy共6个水平，每个剂量水平设置3次重复。供试菌液加入无菌的一次性平板，每个平板10mL菌液，加盖后用封口膜缠绕封口，电子束单面辐照，根据菌液可培养菌落数量计算D₁₀值。

1.3.2 多次辐照的致病菌辐照D₁₀值

供试菌液加入无菌的一次性平板，每个平板10mL菌液，加盖后用封口膜缠绕封口，电子束单面辐照，辐照剂量设定0、0.4、0.8、1.2、1.6、2kGy共6个水平，每个剂量水平设置3次重复。同样操作重复3次，得到多次亚致死剂量辐照的病原菌供试菌液，根据菌液可培养菌落数量分别计算每次辐照的D₁₀值。

1.3.3 亚致死剂量辐照对致病菌生长曲线和生物被膜形成的影响

供试菌液加入无菌的一次性平板，每个平板10mL菌液，加盖后用封口膜缠绕封口。根据致病菌D₁₀值，选择亚致死的剂量辐照供试菌液，电子束单面辐照，辐照剂量设定0、2kGy，每个剂量水平设置3次重复，每个重复10个平板。

1.3.4 亚致死剂量辐照对病原茵混合菌中百分比的影响

将大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌供试菌液等比例混合，制备混合供试菌液。混合供试菌液加入无菌的一次性平板，每个平板10mL菌液，加盖后用封口膜缠绕封口。根据致病菌D₁₀值，选择亚致死的剂量辐照供试菌液，电子束单面辐照，辐照剂量设定0、2kGy，每个剂量水平设置3次重复。

以上所有辐照利用清华同方威视ISl020电子加速器(10Mey、20kW)进行，使用重铬酸银液体化学剂量计对实际辐照剂量进行监测，剂量计的校准按照GB/T16640-2008进行。

1.4 方法

1.4.1 致病菌辐照D₁₀值的计算

D₁₀值是指将微生物总数降低一个数量级的辐照剂量。通过不同辐照剂量对应的致病菌可培养数量的对数值，建立线性拟合方程y=ax+6，D₁₀值即为a的倒数的绝对值，其中：y为辐照剂量；x为致病菌可培养数量的对数值；a、b为常数。

1.4.2 生长曲线测定方法

参考王蒙蒙方法稍做改动。供试菌液5000r/min离心5min，得到微生物菌体沉淀，用无菌生理盐水清洗沉淀后再离心，重复一次，将菌体沉淀用TSB培养基悬浮，控制菌量为10²mL^-1水平。采用12孔板测定，每个孔板加入菌液4mL，35℃下静置培养，定期监测A_600nm值，同时进行PCA平板菌落计数。

1.4.3 生物被膜测定方法

供试菌液于5000r/min离心5min，得到微生物菌体沉淀，用无菌生理盐水清洗沉淀后再离心，重复一次，将菌体沉淀用TSB培养基悬浮，控制菌量为10²CFU/mL水平。采用12孔板测定，每个孔板加入菌液4mL，35℃下静置培养7d，使用结晶紫染色法测定生物被膜。

1.4.4 混合菌百分比分析方法

将处理后的混合供试菌液立即进行PCA平板菌落计数，同时将混合供试菌液5000r/min离心5min，得到微生物菌体沉淀。用无菌生理盐水清洗沉淀后再离心，重复一次，将菌体沉淀用原体积的TSB培养基悬浮，再用TSB培养基适当稀释，调整菌量为10²CFU/mL水平，35℃培养过夜后平板计数检测。大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌分别采用伊红美蓝琼脂、亚硫酸铋琼脂、改良McBride琼脂培养基、甘露醇卵黄多粘菌素琼脂基础平板计数，分析各菌种百分比。

1.5 统计分析

实验数据采用SPSS13.0软件进行分析。

相关链接：沙门氏菌，大肠埃希氏菌，琼脂培养基，蜡样芽孢杆菌B10

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